Structure and function studies on the hERG potassium channel including the development and characterization of membrane mimetics

Beaugrand, Maïwenn (2015). « Structure and function studies on the hERG potassium channel including the development and characterization of membrane mimetics » Thèse. Montréal (Québec, Canada), Université du Québec à Montréal, Doctorat en biochimie.

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Résumé

Les protéines membranaires, notamment eucaryotes, sont connues pour représenter un défi à étudier. Dans cette thèse, des méthodes ont été développées pour aider dans le domaine de recherche des protéines membranaires. Plus précisément, le but de cette thèse était de permettre l'étude de la structure et de la fonction des canaux potassiques voltage-dépendants par résonance magnétique nucléaire. Des membranes modèles pour l'analyse des protéines membranaires ont été développées et caractérisées. Deux types de bicelles ont été étudiés : les bicelles faites avec des phospholipides à courtes chaînes et celles constituées de détergents monoalkylphosphocholines (MAPCHO). Les bicelles couramment utilisées formées de dimyristoyl-phosphatidylcholine (DMPC ou D14PC) et de dihexanoyl-PC (DHPC ou D6PC) ont été étudiées afin de déterminer leur morphologie et leur miscibilité dans des conditions diluées. Les résultats indiquent les concentrations seuils de formation de ces agrégats, la frontière de rapport molaire DMPC / DHPC (q) entre bicelle et micelle mixte ainsi que les meilleures concentrations à utiliser. Afin d'améliorer la solubilisation des protéines membranaires et permettre leur étude en systèmes bicellaires, le DHPC a été remplacé par les détergents de la famille MAPCHO, dont la dodécylphosphocholine (DPC ou DPC12) est connue pour sa capacité à solubiliser les protéines membranaires. Par l'ajout progressif de phospholipides à des mélanges de tensioactifs et de protéines membranaires, la protéine membranaire pourrait être reconstituée dans un environnement bicellaire. Une étude systématique a été menée en variant la longueur de chaîne du phospholipide (C12 à C20) ainsi que du détergent (C12 à C16). Les résultats ont indiqué qu'il était possible de former des systèmes orientés magnétiquement pour six des douze mélanges binaires testés avec différentes épaisseurs de bicouche, à différents rapports molaires lipides / détergents (q) et différentes températures. La qualité de l'alignement, la miscibilité, les concentrations seuils de formation de ces agrégats ainsi que l'effet de l'ajout des ions lanthanides ou des lipides anioniques ont également été étudiés. Une tentative d'établir un critère empirique qui pourrait prédire si une paire donnée de tensioactif et de phospholipide formerait des bicelles a été discutée. Pour évaluer le potentiel de ces membranes modèles comme système de reconstitution directe, des peptides de canaux potassiques ont été solubilisés dans des micelles de DPC, suivi par l'addition de DMPC. Ce projet a permis d'obtenir des données intéressantes sur la structure et les interactions avec les membranes des hélices du pore de Kv1.5 et du human ether-a-go-go related gene (hERG). Un obstacle majeur dans la détermination de structure des protéines membranaires est l'absence de stratégie d'expression et de purification appropriée. La protéine hERG a été sélectionnée pour son implication dans une cardiopathie associée avec d'importants effets hors-cible de médicaments. Un protocole d'expression et de purification efficace du domaine du pore du hERG a été développé. Cela a permis d'obtenir des caractérisations biophysiques et des mesures électrophysiologiques préliminaires. Ces résultats fournissent des méthodes pour solubiliser les protéines membranaires afin de pouvoir les étudier, ainsi que pour réaliser l'expression et la purification du domaine du pore d'un important canal potassique eucaryote : le hERG, qui ouvre la voie à l'obtention de sa structure. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Protéine membranaire, Canal potassique hERG, Membrane modèle, Bicelle, Détergent monoalkylphosphocholine, Résonance magnétique nucléaire.

Type: Thèse ou essai doctoral accepté ()
Informations complémentaires: La thèse a été numérisée telle que transmise par l'auteur.
Directeur de thèse: Marcotte, Isabelle
Mots-clés ou Sujets: Protéines membranaires -- Structure / Canaux potassiques human ether-à-go-go-related-gene / Membranes -- Modèles / Bicelles / Détergents monoalkylphosphocholine (MAPCHO) / Résonance magnétique nucléaire
Unité d'appartenance: Faculté des sciences > Département de chimie
Faculté des sciences > Département des sciences biologiques
Déposé par: Service des bibliothèques
Date de dépôt: 08 mai 2017 13:58
Dernière modification: 08 mai 2017 13:58
Adresse URL : http://www.archipel.uqam.ca/id/eprint/9650

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