Nouvelle approche zymographique pour déterminer l'activité intrinsèque de la diamine oxydase en présence de la catalase dans des formulations bi-enzymatiques

Ahmadifar, Samaneh (2017). « Nouvelle approche zymographique pour déterminer l'activité intrinsèque de la diamine oxydase en présence de la catalase dans des formulations bi-enzymatiques » Mémoire. Montréal (Québec, Canada), Université du Québec à Montréal, Maîtrise en chimie.

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Résumé

La diamine oxydase (DAO, EC 1.4.3.22) est une enzyme à cuivre présente dans les règnes animal et végétal. Elle est impliquée surtout dans le processus de dégradation des amines biogènes dont l'histamine. Un déséquilibre entre la production et la dégradation de l'histamine peut causer des effets indésirables tels que des réactions allergiques, des dysfonctionnements gastro-intestinaux, notamment dans le cas des maladies inflammatoires de l'intestin (i.e. maladie de Crohn). La DAO d'origine végétale a été proposée comme un agent antihistaminique naturel administré par voie orale. Afin de protéger la DAO face à la dégradation par des protéases pancréatiques durant le transit intestinal, elle a été immobilisée dans des microbilles à base d'alginate et de carboxyméthyl amidon (CMA) obtenues par gélification ionotropique avec l'ion Ca2+. La DAO, en catalysant l'oxydation de l'histamine en imidazole-acétaldéhyde, génère également du peroxyde d'hydrogène qui est toxique. Pour neutraliser ses effets néfastes, la catalase a été ajoutée dans la formulation de DAO. Dans ce projet de Maîtrise, les objectifs principaux étaient : i) déterminer la DAO en présence de la catalase (enzyme hautement interférente dans le dosage de la DAO à cause de la décomposition du H2O2; ii) réaliser l'inclusion de la DAO dans des microsphères à base de carboxyméthyl amidon et alginate; iii) évaluer la stabilité de la DAO dans des microsphères suite à l'incubation en conditions simulant le tractus intestinal; iv) déterminer l'activité spécifique intrinsèque de la DAO en présence des enzymes interférentes comme la catalase ou dénaturantes comme des protéases pancréatique. Il est important de mentionner que l'ajout de la catalase dans la formulation DAO ne permet donc pas de mesurer l'activité de DAO par les méthodes usuelles via le dosage de peroxyde d'hydrogène. Dans ce contexte, l'élaboration d'une nouvelle méthode pour déterminer l'activité de la DAO en présence d'autres protéines bioactives a constitué le point central du projet. Ainsi une nouvelle méthode basée sur la zymographie a été élaborée. La DAO et la glucose oxydase ont été soumis à la zymographie dans des conditions dénaturantes (en présence de SDS), mais non réductrices (en absence de β-mercaptoéthanol). La DAO et des protéines contaminantes (catalase et protéase) ont été séparées par électrophorèse sur gel polyacrylamide (PAA) contenant la peroxydase. Suite à l'électrophorèse, le gel a été incubé dans une solution de révélation composée de putrescine (substrat de la DAO) et d'ortho-phénylènediamine (o-PDA, co-substrat de la peroxydase). Afin de calculer l'activité spécifique intrinsèque, une courbe standard a été établie avec des quantités connues de DAO. Les résultats ont aussi montré que les microbilles à base d'alginate/CMA génèrent une bonne protection des enzymes face à la dégradation des protéases pancréatiques. Cette nouvelle approche est une des premières méthodes permettant de déterminer l'activité spécifique intrinsèque de la DAO en présence d'autres enzymes et de protéines interférentes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Diamine oxydase, Catalase, Microbilles à base d'Alginate et de Carboxyméthyl amidon, Détermination de l'activité spécifique intrinsèque par zymographie.

Type: Mémoire accepté
Informations complémentaires: Le mémoire a été numérisé tel que transmis par l'auteur.
Directeur de thèse: Mateescu, Mircea Alexandru
Mots-clés ou Sujets: Histaminase -- Emploi en thérapeutique / Catalase / Microsphères / Carboxyméthylamidon / Alginates / Zymographie / Histamine / Excipients / Affections intestinales inflammatoires
Unité d'appartenance: Faculté des sciences > Département de chimie
Déposé par: Service des bibliothèques
Date de dépôt: 30 août 2017 14:55
Dernière modification: 30 août 2017 14:55
Adresse URL : http://www.archipel.uqam.ca/id/eprint/9830

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